Bioinformatics in agriculture
Miért nehéz a szekvenálásból jövő adat: több változó, mint megfigyelés; hányadokból áll; és ritka eseményről szól.
The semester
Mi jön ki egy szekvenálóból, és mibe kerül
A kimenet rövid leolvasások tömege, nem összefüggő szekvencia. A genom ezekből áll össze.
Az első félreértés, amit érdemes tisztázni. A szekvenáló nem a genomot adja vissza, hanem rövid darabokat: néhány száz bázis hosszú leolvasásokat, véletlenszerű helyekről, sokszorosan átfedve. A genom ezekből áll össze — vagy egy referenciához illesztve, vagy összeállítással. Ebből következik minden további: a lefedettség fogalma, a hiba kezelése, és az, hogy miért nagy ez az adat.
A `bio-sequence` demó beállításai: 200 000 leolvasás, 150 bázis, 300 000 bázisos referencián.
Hogy lássuk, mit jelent az, hogy nem a genomot kapod meg: itt vannak a nagyságrendek. A referenciagenom háromszázezer bázis — ez az, amit meg akarunk ismerni. A szekvenálóból kétszázezer leolvasás jön, egyenként százötven bázis hosszan: ez összesen harmincmillió bázis. Vagyis minden egyes pozíciót átlagosan százszor olvasunk le. Ez nem pazarlás, hanem a módszer lényege. Bázisonként fél százalék a hiba, tehát egyetlen leolvasásnak nem hinnénk el semmit — száznak igen. A genom ebből a százszoros, egymást átfedő törmelékből áll össze.
1
Így néz ki egyetlen leolvasás a fájlban. Négy sor: a név, a bázissorozat, egy elválasztó, és minden bázishoz egy minőségi karakter. Ez az utolsó a lényeg a mai óra szempontjából — mert ugyanannyi karakter, mint a bázis. Nyersen tehát a fájl fele bázis, fele pontszám. Ez nem mérés, hanem a formátum definíciója.
Q = 20 → 1 % hiba · Q = 30 → 0,1 % · Q = 40 → 0,01 %.
A FASTQ negyedik sora minőségértékeket tartalmaz, betűként kódolva — és ezek nem tetszőleges pontszámok, hanem valószínűségek átszámolva. A Phred-érték mínusz tíz szorozva a hibavalószínűség tízes alapú logaritmusával. Ebből jön a szakmában használt három szám: a húszas Phred egy százalék hibát jelent, a harmincas egy ezreléket, a negyvenes egy tízezreléket. És vedd észre a második alakot: ha visszafelé számolsz, a valószínűség exponenciálisan esik — tíz Phred-pontonként tizedére.
200 000 leolvasás, 150 bázis. Ugyanaz a két rész, nyersen és gzip után.
Itt jön az első mért eredmény, és ez az, amiért a blokk a hetedik hétre épül. Nyersen a bázis és a pontszám pontosan harminc-harminc megabájt — ezt a formátum írja elő. Tömörítve viszont már nem: a bázis nyolc egész hat megabájtra megy össze, a pontszám csak tizennyolc egészre. A tömörített fájl kétharmada tehát a minőségi pontszám. Aki tárhelyen akar spórolni, annak nem a szekvencián kell dolgoznia.
A cella betöltése…
Ez a demó teljes kimenete. Két számot emelj ki belőle. Az egyik: a bázis három egész ötszörösére megy össze, a pontszám csak egy egész hétszeresére. A másik: ha a pontszámot nyolc sávra ritkítjuk, tíz megabájtra esik — majdnem a felére. Ezt csinálják a nagy archívumok, és nem hanyagságból: a leolvasás legtöbb felhasználásához nem kell negyven fokozat.
Egy 21-mer = 42 bit = egyetlen egész szám. A következő k-mer egy eltolás és egy maszk.
A szekvenciaelemzés alapfogása. A k-mer a szekvencia k hosszú részlete — mondjuk huszonegy bázis. Négyféle bázis két biten elfér, tehát egy huszonegyes k-mer negyvenkét bit: egyetlen egész szám. És ha a következő k-merre lépsz, az nem új számolás, hanem egy eltolás és egy maszkolás. Ez ugyanaz a gondolat, mint a hetedik héten az oszloporientált tárolás: a tárolás alakja maga a feldolgozás sebessége.
A `bio-sequence` demó tanpéldája: 200 000 leolvasás, 150 bázis, 300 000 bázisos genom.
C=200 * 150 / 300=100×
Húzd a csúszkát, és nézd, mi mozdul.
30 000 leolvasás 21-merjei, kétszeres előfordulástól fölfelé. Az egyszer előfordulók (380 448 k-mer, az összes 55,6 %-a) nem férnek rá — ők a hibák.
Ez az ábra a bioinformatika egyik legtöbbet nézett képe, és modell nélküli minőségellenőrzés. Megszámoljuk, hány k-mer fordul elő egyszer, kétszer, háromszor. Az egyszer előfordulókból háromszáznyolcvanezer van — ezek szinte mind szekvenálási hibát tartalmaznak, mert a hibás k-mer a genomban sehol nincs meg. Az ábráról szándékosan lehagytam őket: egy oszlopban a háromszáznyolcvanezer mellett a többi egy vonallá lapulna. Ami itt látszik, az a másik csúcs, a genomé — tizenegynél.
A mért csúcs 11×. A képlet 11,7-et ad — a kettő egyezése igazolja, hogy jól olvassuk a hisztogramot.
És most egy ellenőrzés, ami miatt ezt a demót szeretem. A várt lefedettség ezen a részhalmazon tizenhárom, a mért csúcs viszont tizenegy. Ez nem hiba. Egy huszonegyes k-mer csak akkor hibátlan, ha mind a huszonegy bázisa az — ez nulla egész kilenc, tehát a k-merek tíz százaléka hibás bázist tartalmaz. Tizenhárom szorozva nulla egész kilenccel: tizenegy egész hét. A mért tizenegy. Ha egy ilyen ellenőrzés kijön, akkor érted, mit mérsz.
A `bio-sequence` demó részmintája: a 21-mer számlálás lefedettsége 13,0×.
csucs=13 * (1 - 0,01)^21=11,7×
Húzd a csúszkát, és nézd, mi mozdul.
Kapsz egy FASTQ-készletet, és a k-mer-hisztogramon a púp öt körül van, pedig a lefedettségnek a leolvasásszám alapján negyvennek kellene lennie. Mi a legvalószínűbb magyarázat?
Kapsz egy FASTQ-készletet, és a k-mer-hisztogramon a púp öt körül van, pedig a lefedettségnek a leolvasásszám alapján negyvennek kellene lennie. Mi a legvalószínűbb magyarázat?
Két út vezet a leolvasásoktól a válaszig. Ha van referenciagenom a fajhoz, akkor illesztünk: megkeressük, honnan származik minden leolvasás. Ha nincs, vagy éppen az érdekel, ami a referenciában nincs benne, akkor összeállítunk. Az agráriumban a főbb szántóföldi növényeknek van referenciájuk; a talajbaktériumok nagy részének nincs.
Az ábra betöltése…
Itt a demó saját ábrája, és ezen látszik az, amit a korábbi dián le kellett vágnom. A jobb oldali hisztogram logaritmikus tengelyen áll, tehát az egyszer előforduló háromszáznyolcvanezer k-mer és a tizenegyes csúcs harmincnégyezerje EGYSZERRE fér rá. Így látod meg, hogy a hibacsúcs nem egy kicsit nagyobb, hanem egy nagyságrenddel — és hogy a kettő között van egy völgy, ami a vágási pontot megmutatja.
Ezt a láncot érdemes egyszer egészben látni, mert a bioinformatika erősen formátumvezérelt: a lépéseket nem a programok kötik össze, hanem a FÁJLFORMÁTUMOK. Ha a formátumokat ismered, bármelyik lépéshez találsz eszközt — és ha egy lánc leírásában elakadsz, az általában azért van, mert nem tudod, melyik formátumban vagy éppen. Balról jobbra: nyers leolvasás, minőségszűrés, illesztés, feldolgozás, variánshívás, elemzés. Mindegyik nyíl egy formátumváltás.
Mikor
A blokk zárógondolata, és ez a legkevésbé technikai mondat az egészben. A szekvencia önmagában nem elemezhető, csak tárolható. Kell hozzá, hogy mikor, hol, milyen mélységből, milyen tétellel vették a mintát. Ez a metaadat a mintavételkor kerül feljegyzésre vagy soha — utólag nem szerezhető meg. Több elemzés bukott már el ezen, mint rossz statisztikán.
| amit rögzíteni kell | miért | mivel |
|---|---|---|
| referenciaváltozat | a pozíciók kiadásonként eltolódnak — két VCF nem vethető össze | a metaadatban és a fájlfejlécben |
| eszközverziók | ugyanaz az illesztő két kiadása más illesztést ad | konténerkép (Docker, Apptainer) |
| paraméterek és küszöbök | a variánsszűrés a lánc legnagyobb hatású döntése | a munkafolyamat leírásában, nem szkriptben |
| véletlenmag | ahol a lépés sorsol, ott a futás nem ismételhető | a lánc paramétereként |
| a lánc maga | hat hónap múlva a parancssori előzmény nincs meg | munkafolyamat-motor (Nextflow, Snakemake) |
Egy genomikai elemzés akkor ér valamit, ha fél év múlva újra elő tudod állítani. Ehhez öt dolgot kell rögzíteni, és mind az öt olyan, amit a fájlok maguk NEM tartalmaznak. A referenciaváltozat, mert a koordináták kiadásonként elcsúsznak. Az eszközverziók, mert egy illesztő két kiadása más eredményt ad. A paraméterek. A véletlenmag, ahol van. És a szűrési küszöbök, mert azok viszik a legnagyobb hatást. Ezt hívják reprodukálhatóságnak, és nem adminisztráció: enélkül a saját eredményedet sem tudod megvédeni.
Húszezer próba, öt valódi hatás — és mit kezdjünk ezzel
300 megfigyelés, 20 000 változó. A tökéletes illeszkedés itt nem eredmény, hanem a dimenziószám következménye.
Ez a genomikai adat legfontosabb tulajdonsága, és a kurzus eddigi anyagának a legnagyobb próbája. Háromszáz nemesítési vonalad van, és húszezer markered. Ilyenkor mindig létezik olyan markerkombináció, amely a hozamot tökéletesen megmagyarázza — akkor is, ha egyetlen marker sem hat. Nem azért, mert hibáztál, hanem mert húszezer dimenzióban háromszáz pont mindig elfér egy síkon.
Minden pont egy marker. A magasság a −log₁₀ p. A 0,05-os küszöb 1,3-nál, a genomszintű 5,6-nál van. A teljes, húszezer pontos ábra a jegyzetfüzetben.
Ez egy szimulált asszociációvizsgálat, és azért szimulált, mert így tudjuk az igazságot: öt marker hat valóban, a többi tizenkilencezer-kilencszázkilencvenöt nem. A függőleges tengelyen a p-érték negatív logaritmusa áll — minél magasabb, annál kisebb a p. Nézd meg, mennyi pont van a 0,05-os vonal fölött. Kilencszáznyolcvannyolc. És ebből négy valódi.
Húsz független próbánál már 64 százalék az esélye legalább egy téves riasztásnak — valódi hatás nélkül.
Itt van számokban, miért nem lehet húszezer próbát öt százalékos szinten futtatni. Ha a próbák függetlenek, annak az esélye, hogy EGYIK sem ad téves riasztást, nulla egész kilencvenöt a k-adik hatványon — és ez k növelésével gyorsan nullához megy. A Bonferroni ezt úgy rendezi, hogy a szintet elosztja k-val; a Holm ugyanezt lépcsősen, és emiatt erősebb. A harmadik sor más kérdésre válaszol: az FDR nem azt szorítja le, hogy legyen-e téves riasztás, hanem azt, hogy a TALÁLATOK hány százaléka téves.
| küszöb | találat | ebből valódi | ebből hamis |
|---|---|---|---|
| p < 0,05 | 988 | 4 | 984 |
| genomszintű, p < 2,5·10⁻⁶ | 3 | 3 | 0 |
| FDR 5 % | 3 | 3 | 0 |
Itt a mért eredmény táblázatban. Ötszázalékos p-értékkel kilencszáznyolcvannyolc találat, ebből négy valódi: a lista nulla egész négy százaléka igaz, tehát használhatatlan. A genomszintű küszöb — a nulla nulla öt elosztva húszezerrel — három találatot hagy, és mind a három valódi. A hamis felfedezési arány szerinti eljárás itt ugyanazt adja. De figyelj a második oszlopra is: a genomszintű küszöb két valódi hatást elveszít.
Az ábra betöltése…
Hogy a húszezer marker ne tűnjön külön világnak, itt ugyanez a jelenség húsz kezelésen. Húsz készítmény, mindegyik teljesen hatástalan, tizenkét ismétléssel. Korrekció nélkül az esetek negyvennyolc százalékában lesz köztük legalább egy szignifikáns, és futásonként átlagosan egy egész huszonkilenc találat. Holm-korrekcióval ugyanez nyolc egész két százalék — ott van, ahol lennie kell. Érdemes megnézni a tankönyvi képletet is: hatvannégy egész kettőt jósol. A mért érték tizenhat ponttal kisebb, mert a húsz próba ugyanazt a kontrollt használja, tehát nem függetlenek. Ez a szám tehát nem cáfolat, hanem a kísérlet szerkezetének lenyomata.
A cella betöltése…
A demó kimenetében ott van az, amit a táblázat nem mond el. Az öt valódi hatás nagysága nulla egész negyvenöt, harmincöt, huszonnyolc, húsz és tizennégy szórásegység. A genomszintű küszöb az első hármat megtalálja, az utolsó kettőt nem. Ez nem a küszöb hibája — ez a küszöb ára. Háromszáz vonalból egy nulla egész tizennégyes hatást nem lehet ilyen szigorú küszöbbel kimutatni, akárhogy is szeretnénk.
Egy kolléga azzal jön, hogy talált egy markert, amely nulla nulla egyes p-értékkel kapcsolódik a szárazságtűréshez, és szeretné beépíteni a nemesítési programba. Mi az első kérdésed?
Egy kolléga azzal jön, hogy talált egy markert, amely nulla nulla egyes p-értékkel kapcsolódik a szárazságtűréshez, és szeretné beépíteni a nemesítési programba. Mi az első kérdésed?
Ha a minta alcsoportokra bomlik, és az alcsoportok a tulajdonságban is eltérnek, akkor minden csoportjelző marker „találat” lesz.
És most a csapda, amit a küszöb nem old meg. Tegyük fel, hogy a mintád kétféle tájfajtából áll, és az egyik csoport átlagosan jobb hozamú — akár a genetikától teljesen független okból, mondjuk mert máshol termesztik. Ekkor minden marker, amely a két csoportot megkülönbözteti, kapcsolatot mutat a hozammal. Nem hamis pozitív a szó statisztikai értelmében: a kapcsolat valóban ott van az adatban. Csak nem oksági, és a nemesítésben haszontalan.
Az ábra betöltése…
Ez ugyanaz a paradoxon, csak ismerősebb adaton — az 5. hétről már láttad. Kilenc tábla, mindegyiken nitrogén és hozam. Táblán BELÜL a meredekség pozitív, nulla egész nulla-egy-egy-négy, és mind a kilencen pozitív. Összevonva mínusz nulla egész nulla-négy-három-kilenc: ellentétes előjel, ugyanabból az adatból. Az ok nem statisztikai, hanem agronómiai: a gyengébb táblákra megy több nitrogén. A genomikában a tábla helyét az alcsoport veszi át. Ha a minta populációkra bomlik, és a populációk a tulajdonságban is eltérnek, akkor minden csoportjelző marker találatnak fog látszani — pedig csak a származást jelzi.
Itt válik szét a két megközelítés, és ez a blokk gyakorlati tanulsága. A markerkeresés azt kérdezi: melyik marker hat. Ez akkor működik, ha van néhány nagy hatású marker — betegségellenállóságnál gyakran van ilyen. A hozam viszont nem így működik: sok száz kis hatás eredője. Ott nem markert keresünk, hanem az összeset együtt használjuk tenyészérték becslésére. A küszöb ilyenkor nem is kell — nem listát közlünk, hanem rangsorolunk.
Az ábra betöltése…
A korábbi dián csak huszonhárom pontot tudtam megmutatni a húszezerből, mert a keretrendszer rajza nem visz el ennyit. Itt a demó saját ábrája az összessel. Most látod, mi az igazi arány: a szürke felhő a tizenkilencezer-kilencszázkilencvenöt nem ható marker, és a nulla nulla ötös vonal fölött ebből majdnem ezer ül. Az öt narancs pont a valódi hatás — kettő közülük a felső vonal alatt marad, tehát elveszne.
Az örökölhetőség felső korlát a genomikus becslés magyarázóerejére. A fölötte lévő eredmény gyanú, nem siker.
Egy szám, amit érdemes minden ilyen projekt elején kiírni a táblára. Az örökölhetőség azt mondja meg, a megfigyelt változékonyság mekkora hányada magyarázható genetikai különbséggel. Ha egy tulajdonság örökölhetősége nulla egész három, akkor a legjobb genomikus modell sem magyarázhat többet harminc százaléknál — a maradék a környezet és a mérés. Aki ennél jobb eredményt közöl, az vagy szivárogtat, vagy a környezetet tanulta meg.
A `bio-gwas` demó mérése: az öt valódi markerhatás, és amit a genomszintű küszöb meghagy.
Itt látszik, miért nem a markerlista a cél. A generátorba öt valódi hatást raktunk, és tudjuk, mekkorák — szórásegységben nulla egész negyvenöt, harmincöt, huszonnyolc, húsz és tizennégy. A genomszintű küszöb a felső hármat találja meg. A két gyengébbet levágja: nem azért, mert nincsenek ott, hanem mert ennyi megfigyeléssel nem lehet megkülönböztetni őket a zajtól. A megtalálható rész tehát felülről korlátos, és ezt a korlátot a mintaszám és az örökölhetőség adja, nem a módszer. Aki a korlát fölötti magyarázóerőt közöl, az nem jobb modellt talált, hanem szivárgást.
A megfigyelt változatosság genetikai hányada. A szűk értelmű h² az, ami a szelekcióban számít.
Az örökölhetőség a megfigyelt változatosság genetikai hányada. A tág értelmű a teljes genetikai varianciát nézi, a szűk értelmű csak az additív részt — és a nemesítésben ez utóbbi számít, mert csak az additív rész öröklődik megbízhatóan. Két dolgot érdemes megjegyezni róla. Az első: felső korlát arra, amit BÁRMILYEN marker alapú modell elérhet. A második, amit gyakran elfelejtenek: az örökölhetőség nem a tulajdonság állandója, hanem a POPULÁCIÓÉ és a környezeté. Ugyanaz a tulajdonság más állományban más h²-t ad.
Rokonság szerinti szétvágás, nem véletlen. És a tétel ne essen egybe a vizsgált csoporttal.
És ebből következik a blokk utolsó gyakorlati szabálya. A nyolcadik héten azt mondtuk, hogy ugyanabból a táblából ne kerüljön minta a tanítóba és a tesztbe. Itt ugyanez a rokonságra vonatkozik. Ha egy vonal testvére benne van a tanítóhalmazban, akkor a teszteredmény hazudik — a modell a családot ismerte fel, nem a genetikát. És ugyanígy a tétel: ha az egyik csoportot tavaly, a másikat idén genotipizálták, akkor a tételhatás és a csoport szétválaszthatatlan.
A `cv-leakage` demó mérése: 100 egyed, egyedenként 5 felvétel, kétféle szétvágással.
Mérés arra, mit csinál a rossz szétvágás, ha a megfigyelések nem függetlenek. Ez képi adat, de a szerkezete ugyanaz, mint a rokonságé: száz növény, mindegyikről öt felvétel. Ha képenként sorsolunk, a pontosság kilencvenkilenc egész nyolc. Ha növény szerint vágunk — egy növény minden képe egy oldalra kerül —, hatvannégy egész nulla. Harmincöt egész nyolc százalékpont a különbség, és nem a modellről szól. A mechanizmus is látszik: véletlen szétvágásnál a teszt képek kilencvennyolc egész négy százalékának a legközelebbi szomszédja ugyanannak a növénynek egy másik felvétele. A modell nem a betegséget ismeri fel, hanem az egyedet. Genomikán a testvérvonal pontosan ezt csinálja.
Zárt adat, zárási hatás, és mit mér valójában a korreláció
A leolvasásszám a szekvenálásról szól, nem a talajról. Ezért hányaddal dolgozunk — és ettől az összeg rögzített.
Az első dolog, amit tisztázni kell. A 16S-vizsgálat leolvasásokat ad, és a leolvasások száma mintánként más — attól függ, mennyi került a szekvenálóba, nem attól, mennyi baktérium volt a talajban. Ezért mindenki relatív gyakoriságra vált: hány százalékát teszi ki egy taxon a leolvasásoknak. Ez elkerülhetetlen, és ez a forrása minden további bajnak. Az összeg ugyanis ettől kezdve rögzített: mindig száz százalék.
A `bio-compositional` demó beállítása: 120 talajminta, 12 taxon, egy domináns.
Hogy lássuk, miért nem ártatlan a hányad: ebben a mérésben tizenkét taxon osztozik a leolvasásokon, és az egyik egymaga negyvenkilenc egész négy százalékot visz. A többi tizenegy átlagosan négy egész hat százalékot. Most gondold végig, mi történik, ha a domináns taxon abszolút mennyisége megnő a talajban. A leolvasásszám nem nő, mert a szekvenáló kapacitása rögzített — tehát a többi taxon hányada MIND lecsökken, anélkül hogy a talajban bármelyikük megfogyott volna. Ez nem ökológia, hanem az összeg rögzítettsége. Ezért nem lehet a hányadokat úgy olvasni, mintha mennyiségek lennének.
Mért ↔ számolt: 3 taxon −0,500 ↔ −0,500 · 6: −0,200 ↔ −0,200 · 12: −0,090 ↔ −0,091 · 40: −0,025 ↔ −0,026 · 200: −0,005 ↔ −0,005
Ha az összeg rögzített, akkor az egyik rész növekedése a többi csökkenése. Ez nem ökológia, hanem számtan. Egyenlő nagyságú részeknél a hamis korreláció pontosan kiszámolható: mínusz egy per k mínusz egy. Három résznél ez mínusz egy fél — óriási. Kétszáz résznél mínusz nulla nulla nulla öt — elhanyagolható. A demó mind az öt esetet lemérte, és a mért érték három tizedesjegyig egyezik a képlettel.
12 taxon, egyikük a leolvasások 49,4 %-a. Az abszolút mennyiségek függetlenek — minden korreláció, ami itt látszik, a zárás műve.
Ez a blokk legfontosabb ábrája. Ugyanaz a száztizenhúsz minta, tizenkét taxon, amelyek abszolút mennyisége egymástól független — ezt tudjuk, mert mi állítottuk elő. A relatív gyakoriságon az átlagos korreláció mínusz nulla nulla kettő: gyakorlatilag nulla. Ha csak ezt nézed, azt mondod, nincs baj. De bontsd szét. A domináns taxon párjainál mínusz nulla egész négy, a többi páron plusz nulla egész nyolc. Az átlag azért nulla, mert a kettő kioltja egymást.
Az ábra betöltése…
A hisztogram azt mondta meg, hogy VAN hamis korreláció. Ez megmondja, HOL. Két korrelációs mátrix, ugyanazokra a taxonokra. Bal oldalt az abszolút bőség: egyenletesen halvány, nincs szerkezet — ahogy kell, hiszen függetlennek állítottuk elő. Jobb oldalt a relatív gyakoriság. Nézd meg az első sort és az első oszlopot: végig sötétkék, vagyis erősen negatív. Az a domináns taxon. És nézd meg a maradék mezőt: enyhén piros, tehát gyengén pozitív. Egyik sem ökológia.
A cella betöltése…
Most jön az a rész, amit szeretnék, ha megjegyeznél — nem a számot, hanem az eljárást. Amikor ezt a demót megírtam, azt a mondatot írtam a végére, hogy a centrált logaritmikus arány visszahozza a korrelációt a nullához. Ezt olvastam, ezt hittem. Aztán lefuttattam, és mínusz nulla nulla kilencet kaptam — rosszabbat, mint a nyers relatív gyakoriságon. Nem a mérést javítottam ki, hanem a mondatot.
log(a/s) − log(b/s) = log(a) − log(b). Az osztó kiesik — ezért használható zárt adaton.
Mi az, ami működik? Az, amiből az osztó kiesik. Ha két taxon hányadának a logaritmusát kivonod egymásból, akkor az összeg, amivel osztottunk, eltűnik: log a per s mínusz log b per s egyenlő log a mínusz log b. Ez nem trükk, hanem a zárt adat egyetlen értelmes algebrája. Az erre épülő arányossági mérőszám azt kérdezi, hogy a két taxon log-arányának szórása kicsi-e — és ez a kérdés attól független, mire normáltunk.
A `bio-compositional` demó mérése: az átlagos páronkénti korreláció három ábrázolásmódon.
Ezt a diát a saját tévedésem miatt kellett átírni, ezért érdemes megnézni. Az abszolút bőségen az átlagos korreláció mínusz nulla egész nulla-nulla-három — nulla körül, ahogy előállítottuk. A relatív gyakoriságon mínusz nulla egész nulla-nulla-kettő: látszólag semmi. A centrált log-arányon mínusz nulla egész nulla-kilenc-egy — vagyis a CLR nem javítja meg, hanem rontja. Az ok az, hogy a CLR maga is nullára összegződik: kicseréli az egyik zárást egy másikra. Ami tényleg működik, az a páronkénti log-arány, amiből az arányosság számolható: ott nulla egész nulla-öt-hét jön ki. A log-arány tehát nem azért jó, mert transzformáció, hanem mert az OSZTÓ kiesik belőle.
Egy mikrobiom-tanulmány azt közli, hogy két talajbaktérium-csoport erősen negatívan korrelál, és ebből versengésre következtet. Az egyik csoport a leolvasások negyven százalékát teszi ki. Mi az első ellenvetésed?
Egy mikrobiom-tanulmány azt közli, hogy két talajbaktérium-csoport erősen negatívan korrelál, és ebből versengésre következtet. Az egyik csoport a leolvasások negyven százalékát teszi ki. Mi az első ellenvetésed?
Mélyebb szekvenálás = több megtalált ritka taxon = magasabb mért diverzitás, változatlan talajon.
Egy második, kevésbé látványos csapda, ami ugyanoda vezet. A diverzitás — hányféle taxont találtunk — függ attól, hány leolvasás jutott a mintára. Mélyebben szekvenálva több ritka taxont látsz meg, tehát magasabb diverzitást mérsz, ugyanazon a talajon. Ha a mintáid mélysége eltér, akkor a diverzitáskülönbségük részben a szekvenálásról szól, nem a talajról.
Az ábra betöltése…
A demó teljes ábrája. Bal oldalt a taxonpárok korrelációinak eloszlása három alakban: az abszolút bőség nulla körül, ahogy kell; a relatív gyakoriság szélesebben; a centrált log-arány pedig — és ez az, amit rosszul tudtam — még szélesebben. Jobb oldalt a mért átlag és a képlet: három taxontól kétszázig három tizedesjegyig egyeznek. Ha egy elméleti képlet és egy szimuláció ilyen pontosan egyezik, akkor mindkettőt jól csináltuk.
| lépés | mit ad | amit nem mond ki |
|---|---|---|
| minőségszűrés, párosítás | tisztított leolvasások | a mélység mintánként eltérő marad |
| leolvasás-feldolgozás (DADA2, QIIME 2) | ASV- vagy OTU-táblázat | innentől az adat HÁNYAD, nem sejtszám |
| taxonómiai besorolás | ki melyik taxon | a besorolás adatbázisfüggő és hiányos |
| normálás, ritkítás | összevethető minták | a ritkítás adatot dob el — és ezt ki kell mondani |
| diverzitás, összehasonlítás | alfa- és béta-diverzitás | a korreláció kompozicionális adaton hamis jelet ad |
A mikrobiom-oldalon is végig kell nézni a láncot, mert itt van egy csapda, amiről a lánc vége nem szól. A nyers leolvasásból a feldolgozó lánc taxon-táblázatot csinál, és ez a táblázat HÁNYADOKAT tartalmaz, nem sejtszámot. A program nem mondja ki, hogy ettől kezdve kompozicionális adattal dolgozol — a felhasználónak kell tudnia. Nézd meg a harmadik oszlopot: minden lépésnél odaírtam, mit NEM kap meg az ember.
Három mérőszám, három súlyozás: a ritkák számítanak-e, és mennyire.
A diverzitás nem egyetlen szám, hanem egy család — és a tagjai másra érzékenyek. A fajgazdagság csak megszámolja a taxonokat: a ritkákat ugyanúgy súlyozza, mint a dominánsakat, ezért a leolvasási mélységre nagyon érzékeny. A Shannon-index a hányadokat logaritmikusan súlyozza: a ritkák számítanak, de kevésbé. A Simpson-index pedig négyzetre emel, tehát szinte csak a dominánsakat nézi. Ha két minta Shannon-indexe azonos, de a Simpsonja nem, akkor a különbség a ritka taxonokban van.
Ha a tétel egybeesik a csoporttal, a hatásuk szétválaszthatatlan. Ez tervezési kérdés, nem elemzési.
És a harmadik, ami minden szekvenálásos projektet fenyeget. A feldolgozás körülménye — melyik futtatás, melyik kit, melyik labor — nyomot hagy az adaton, és ez a nyom gyakran erősebb, mint a biológiai jel. A veszélyes eset nem az, hogy van tételhatás. Az, hogy a tétel egybeesik a vizsgált csoporttal: a kezelt mintákat kedden dolgozták fel, a kontrollt csütörtökön. Ekkor a kettő szétválaszthatatlan, és nincs az a statisztika, amivel utólag ki lehetne bogozni.
A `cv-domainshift` demó mérése: ugyanaz a modell, más felvételi körülmények között.
A tételhatást talajmintán nehéz kimérni, mert nem tudjuk, mi lett volna a másik tétellel. Képi adaton viszont igen, és a szerkezete ugyanaz. Ugyanaz a modell, ugyanaz az adat, egyetlen különbség: a felvételek más megvilágításban készültek. Azonos fényen kilencvenegy egész egy százalék, eltolt fényen hetvenkilenc egész öt — tizenegy egész hat pontos esés. És ami a legkellemetlenebb: a modell erről nem szól. A döntéseihez tartozó magabiztossága alig változik. A csatornánkénti fehéregyensúly a romlás nyolcvanöt százalékát visszahozza, de ez utólagos javítás. A helyes válasz a mintavétel tervezésénél van: a tétel ne essen egybe a vizsgált csoporttal.
Egy jó teszt is rosszul szól, ha a kórokozó ritka
| szám | mit mond | miről szól |
|---|---|---|
| Érzékenység | megtalálja-e a fertőzöttet | a tesztről |
| Fajlagosság | hallgat-e az egészségesre | a tesztről |
| Alapgyakoriság | milyen gyakori a kórokozó | az ÁLLOMÁNYRÓL — és mégis ez dönt |
A tesztekről rendszerint két számot közölnek. Az érzékenység azt mondja meg, a fertőzöttet mekkora eséllyel találja meg. A fajlagosság azt, hogy az egészségesre mekkora eséllyel nem szól. Mindkettő a tesztről szól, és mindkettő rögzített. De az a kérdés, ami téged érdekel — hogy egy pozitív eredmény mit jelent — ebből a kettőből nem válaszolható meg. Kell hozzá egy harmadik szám: hogy milyen gyakori a kórokozó abban az állományban, ahol vizsgálsz.
A pozitív lelet jelentése a fertőzöttségtől függ — ugyanaz a teszt, más állomány, más következtetés.
Itt van a három szám kapcsolata képletben. A pozitív prediktív érték — vagyis hogy egy pozitív lelet mögött tényleg fertőzés áll-e — a Bayes-tételből jön, és benne van a fertőzöttség. Ebből következik a második képlet, ami a modul egyik legszebb eredménye: ki lehet számolni, milyen fertőzöttség alatt lesz a pozitívak TÖBBSÉGE téves. A válasz egy per plusz — és a mi tesztünkre ez egy egész nulla négy százalék. A demó ezt meg is méri, és ugyanez jön ki.
A `bio-diagnosis` demó tesztje: 95 % érzékenység, 99 % fajlagosság.
PPV=0,95 * 0,01 / (0,95 * 0,01 + (1 - 0,99) * (1 - 0,01))=0,49arány
Húzd a csúszkát, és nézd, mi mozdul.
Érzékenység 95 %, fajlagosság 99 %. A vízszintes tengely a fertőzöttség százalékban.
Itt a mérés. Kilencvenöt százalékos érzékenység, kilencvenkilenc százalékos fajlagosság — ez jó tesztnek számít. A vízszintes tengelyen a fertőzöttség, a függőlegesen az, hogy a pozitívak hány százaléka valódi. Nézd meg a bal oldalt. Ezrelékes fertőzöttségnél a pozitívak nyolc egész hét százaléka valódi: minden tizenegyedik riasztás igaz, a többi tíz téves. Egy százaléknál negyvenkilenc: minden második.
A cella betöltése…
A demó kiszámolja azt a pontot is, ahol a pozitívak fele valódi: egy egész nulla négy százalékos fertőzöttségnél. Ez alatt a riasztásaid többsége téves. Érdemes ezt a számot megnézni közelebbről — nem a tesztről szól, hanem arról, hogy a fajlagosság hiánya, az az egy százalék, mennyi téves riasztást termel. Ezer mintából tíz téves pozitív jön ki mindig, függetlenül a fertőzöttségtől. A valódiak száma viszont a fertőzöttséggel együtt mozog.
Három út van, és mindhárom valódi költséggel jár. Növelheted a fajlagosságot — de ez rendszerint drágább tesztet jelent. Csinálhatsz megerősítő vizsgálatot a pozitívakon: az első kör olcsó és érzékeny, a második drága és fajlagos. Vagy szűkítheted, hol szűrsz: ha a kockázatos állományokra koncentrálsz, az alapgyakoriság ott magasabb, és ugyanaz a teszt hasznosabb lesz. Ez utóbbi a legolcsóbb, és a legtöbben elfelejtik.
1 %-os fertőzöttségnél, tízes gyűjtésnél: 200 teszt 1000 helyett — ötszörös megtakarítás.
A ritka kórokozó szűrésének a szokásos eszköze. Tíz mintát összeöntesz, és egyszer vizsgálod meg. Ha negatív, mind a tíz negatív — egy teszttel tíz mintát zártál le. Ha pozitív, akkor a tízet külön is meg kell nézni. Egyszázalékos fertőzöttségnél a demó szerint ezer minta kétszáz teszttel elintézhető, ezer helyett. Ötszörös megtakarítás. De van egy ár, amit a számítás nem tartalmaz.
A `bio-diagnosis` demó számítása: 1000 minta átvizsgálása 1 %-os fertőzöttségnél.
A gyűjtött vizsgálat számtana egyszerű, és ezen az ábrán el is fér. Ezer mintát kell átnézni, egy százalékos fertőzöttség mellett. Egyenként vizsgálva ezer teszt. Tízesével gyűjtve először száz teszt fut le a gyűjtött mintákra, aztán azokat a tízeseket, amelyek pozitívak lettek, egyenként is meg kell vizsgálni — ez összesen kétszáz teszt. Ötször kevesebb. A megtakarítás valódi, de két dolgot fizetsz érte. Az egyik: két kört kell szervezni, tehát hosszabb az átfutás. A másik a következő dián jön, és az a fontosabb.
Tíz mintában egy fertőzött = tizedannyi célmolekula. A gyűjtött vizsgálat érzékenysége kisebb, és a gyenge fertőzésnél a legkisebb.
Ez az ár. Ha tíz mintában egy fertőzött van, akkor a célmolekulából tizedannyi jut a vizsgálatba. A gyenge fertőzés így a kimutatási határ alá csúszhat — vagyis a gyűjtött minta érzékenysége kisebb, mint az egyedié, és éppen a kezdődő, még kezelhető fertőzéseknél a legrosszabb. Szeretném, ha ezt a mondatot megjegyeznéd: a megtakarítást a demó megmondja, a hígulást neked kell hozzátenni.
Az ábra betöltése…
És a demó saját ábrája, ahol a vízszintes tengely logaritmikus. Ez azért kell, mert a lényeg a bal szélen történik: ezrelékes és egyszázalékos fertőzöttség között zuhan a pozitív prediktív érték nyolc egész hétről negyvenkilencre. Lineáris tengelyen ez az egész szakasz az ábra bal két százalékába préselődne, és pont az nem látszana, amiről a blokk szól.
Egy szűrési programban ezer mintát vizsgálnak évente, és a pozitívakat mind kezelik. A becsült fertőzöttség fél százalék, a teszt fajlagossága kilencvenkilenc százalék. A gazda azt kérdezi, miért kezelünk annyi tünetmentes állományt. Mit válaszolsz?
Egy szűrési programban ezer mintát vizsgálnak évente, és a pozitívakat mind kezelik. A becsült fertőzöttség fél százalék, a teszt fajlagossága kilencvenkilenc százalék. A gazda azt kérdezi, miért kezelünk annyi tünetmentes állományt. Mit válaszolsz?
Nyolc projekt, belépő, közép és haladó szinten. Mindegyik nyilvános adaton, egyetlen laptopon fut.
Ezzel a modul végére értünk. Nyolc projekt van kidolgozva, és mind fut egyetlen laptopon, nyilvános adaton — laborhozzáférés nélkül. Kettő a nemesítéshez tartozik, kettő a mikrobiomhoz, egy a diagnosztikához, egy a tárolási kérdéshez, és kettő a köztes témákhoz. Amit mindegyikben ugyanúgy kérek: az első oldalon álljon ott, hány megfigyelés van hány változóval szemben, és mi az alapgyakoriság.
a szekvenáló darabokat ad, a lefedettség pedig azt, hányszor olvastunk le egy bázist
a nyers formátum, és a bázisonkénti hibavalószínűség logaritmikus kódolása
k hosszú darabok, és a gyakoriságuk eloszlása; a csúcs helye a lefedettségből jön
egybázisos eltérés, és a húszezer próbához igazított szigorúbb határ
az ÖSSZES marker együtt, és a belőle becsült rangsor
hányad, nem sejtszám; a rögzített összeg hamis negatív korrelációt szül
a fertőzöttség, és belőle az, hogy egy pozitív lelet mögött mennyi az esély
Egy mondatban, amit szeretnék, ha megmaradna: a szekvenálásból jövő adat nem azért nehéz, mert biológia. Azért, mert több benne a változó, mint a megfigyelés, mert hányadokból áll, és mert ritka eseményről szól. Mind a három olyan tulajdonság, amire a kurzus eddigi hetei felkészítettek.
| Rövidítés | Feloldás | Mit jelent |
|---|---|---|
| FASTQ | FASTA + Quality | nyers leolvasás minőségértékekkel; négy sor rekordonként |
| SAM | Sequence Alignment/Map | az illesztés szöveges formátuma: melyik leolvasás hova került |
| BAM | Binary Alignment/Map | ugyanaz tömörítve és indexelve — az index miatt olvasható ki egyetlen régió |
| VCF | Variant Call Format | a variánsok táblázata: pozíció, allél, minőség, mintánkénti genotípus |
| SNP | Single Nucleotide Polymorphism | egyetlen bázis eltérése; a nemesítési markerek többsége ilyen |
| GWAS | Genome-Wide Association Study | genomszintű asszociációvizsgálat: minden markerre külön próba |
| FDR | False Discovery Rate | a találatok között a tévesek várható aránya |
| PPV | Positive Predictive Value | a pozitívak közül hány valódi — a fertőzöttségtől függ, nem csak a teszttől |
| OTU | Operational Taxonomic Unit | hasonlósági küszöb szerint összevont leolvasáscsoport |
| ASV | Amplicon Sequence Variant | pontos szekvenciaváltozat, küszöb nélkül — az OTU újabb váltása |
| CLR | Centered Log-Ratio | centrált log-arány: a kompozicionális adat szokásos átalakítása |
| qPCR | quantitative Polymerase Chain Reaction | mennyiségi PCR: a célmolekula mennyiségét is megadja |
| DNS | dezoxiribonukleinsav | a genetikai információ hordozója; angolul DNA |
| ASCII | American Standard Code for Information Interchange | karakterkódolás; a Phred-érték + 33 ebben a kódban áll a FASTQ-ban |
| TP, FP, FN, TN | a zavarási mátrix négy cellája | valódi találat, téves riasztás, kimaradt eset, helyes nem — a 8. hét vezeti be |
| BWA | Burrows–Wheeler Aligner | rövid leolvasások illesztője; programnév, a mögötte álló algoritmusról elnevezve |
| GATK | Genome Analysis ToolKit | variánshívó eszköztár; programnév |
| PLINK, QIIME, DADA2, FastQC | programnevek, nem rövidítések | genotípus-elemzés, amplikon-lánc, leolvasás-feldolgozás, minőségellenőrzés |
A bioinformatika a kurzus legrövidítésesebb területe, és ez nem véletlen: a lánc lépéseit FÁJLFORMÁTUMOK kötik össze, és a formátumoknak betűszó a nevük. Ha ezt a táblát ismered, egy idegen lánc leírását is végig tudod olvasni.
Az ábra betöltése…
A modul négy típusa. A pontfelhő panel itt fontosabb, mint amennyit a helye sugall: a Manhattan-ábra húszezer markere csak így fér el egy rajzon, és a küszöb fölé kerülő néhány pont ebből látszik. Vedd észre, hogy ezen az egy panelen a vízszintes tengely NEM sorszám, hanem egy másik mennyiség — ettől lesz pontfelhő, és nem vonal.
| diagramtípus | mit olvasol le róla | mire NEM jó |
|---|---|---|
| oszlop | kategóriák nagyságrendje és sorrendje — a hossz maga az érték | időbeli alakulás: a sorrend nem látszik rajta |
| vonal | időbeli alakulás: a meredekség és a fordulópontok | kategóriák összevetése: a vonal sorrendet állít oda is, ahol nincs |
| pontfelhő | két mennyiség együttmozgása, egy pont egy megfigyelés | időbeli sorrend: a pontokból nem derül ki, melyik volt előbb |
| demóábra | amit a keretrendszer rajza nem tud: log tengely, hőtérkép, kis sokszorosok | saját adatod: ez a demó kimenete, nem szerkeszthető a dián |
A modul diagramtípusai. A pontfelhő itt egyetlen helyen áll, de ott kihagyhatatlan: a Manhattan-ábra húszezer markere csak így fér el, és a küszöb fölé kerülő néhány pont ebből látszik.