Lecture 10
Bioinformatics in agriculture
Miért nehéz a szekvenálásból jövő adat: több változó, mint megfigyelés; hányadokból áll; és ritka eseményről szól.
Start with AikoDeck68 slides · 90 min
01
Bioinformatika: a szekvenciaadat
Mi jön ki egy szekvenálóból, és mibe kerül
Üdv. Ez a modul nem heti anyag, hanem projektcsomag — abból választasz féléves feladatot. És mielőtt bárki megijedne: itt nem molekuláris biológiát fogunk tanulni. Azt fogjuk megnézni, hogy a szekvenálásból jövő adat milyen adatelemzési feladat. Ha a hetedik héten végigcsináltad a tárolást, akkor ennek a blokknak a fele már ismerős lesz.
02
Nem a genomot kapod meg
A kimenet rövid leolvasások tömege, nem összefüggő szekvencia. A genom ezekből áll össze.
Az első félreértés, amit érdemes tisztázni. A szekvenáló nem a genomot adja vissza, hanem rövid darabokat: néhány száz bázis hosszú leolvasásokat, véletlenszerű helyekről, sokszorosan átfedve. A genom ezekből áll össze — vagy egy referenciához illesztve, vagy összeállítással. Ebből következik minden további: a lefedettség fogalma, a hiba kezelése, és az, hogy miért nagy ez az adat.
03
Harmincmillió bázis, háromszázezerre
A `bio-sequence` demó beállításai: 200 000 leolvasás, 150 bázis, 300 000 bázisos referencián.
Hogy lássuk, mit jelent az, hogy nem a genomot kapod meg: itt vannak a nagyságrendek. A referenciagenom háromszázezer bázis — ez az, amit meg akarunk ismerni. A szekvenálóból kétszázezer leolvasás jön, egyenként százötven bázis hosszan: ez összesen harmincmillió bázis. Vagyis minden egyes pozíciót átlagosan százszor olvasunk le. Ez nem pazarlás, hanem a módszer lényege. Bázisonként fél százalék a hiba, tehát egyetlen leolvasásnak nem hinnénk el semmit — száznak igen. A genom ebből a százszoros, egymást átfedő törmelékből áll össze.
04
Egy FASTQ-rekord négy sora
1: @olvasas_1 — név · 2: `GATTACAGGC…` — a bázisok · 3: + — elválasztó · 4: `IIIIHHHGGF…` — bázisonként egy minőségi karakter
Így néz ki egyetlen leolvasás a fájlban. Négy sor: a név, a bázissorozat, egy elválasztó, és minden bázishoz egy minőségi karakter. Ez az utolsó a lényeg a mai óra szempontjából — mert ugyanannyi karakter, mint a bázis. Nyersen tehát a fájl fele bázis, fele pontszám. Ez nem mérés, hanem a formátum definíciója.
05
A Phred-minőség képlete
Q = 20 → 1 % hiba · Q = 30 → 0,1 % · Q = 40 → 0,01 %.
A FASTQ negyedik sora minőségértékeket tartalmaz, betűként kódolva — és ezek nem tetszőleges pontszámok, hanem valószínűségek átszámolva. A Phred-érték mínusz tíz szorozva a hibavalószínűség tízes alapú logaritmusával. Ebből jön a szakmában használt három szám: a húszas Phred egy százalék hibát jelent, a harmincas egy ezreléket, a negyvenes egy tízezreléket. És vedd észre a második alakot: ha visszafelé számolsz, a valószínűség exponenciálisan esik — tíz Phred-pontonként tizedére.
06
Nyersen fele-fele, tömörítve nem
200 000 leolvasás, 150 bázis. Ugyanaz a két rész, nyersen és gzip után.
Itt jön az első mért eredmény, és ez az, amiért a blokk a hetedik hétre épül. Nyersen a bázis és a pontszám pontosan harminc-harminc megabájt — ezt a formátum írja elő. Tömörítve viszont már nem: a bázis nyolc egész hat megabájtra megy össze, a pontszám csak tizennyolc egészre. A tömörített fájl kétharmada tehát a minőségi pontszám. Aki tárhelyen akar spórolni, annak nem a szekvencián kell dolgoznia.
07
A teljes mérés
A `bio-sequence` demó kimenete. Ugyanez a cella a bio_szekvencia.ipynb jegyzetfüzetben.
Ez a demó teljes kimenete. Két számot emelj ki belőle. Az egyik: a bázis három egész ötszörösére megy össze, a pontszám csak egy egész hétszeresére. A másik: ha a pontszámot nyolc sávra ritkítjuk, tíz megabájtra esik — majdnem a felére. Ezt csinálják a nagy archívumok, és nem hanyagságból: a leolvasás legtöbb felhasználásához nem kell negyven fokozat.
08
A k-mer, és miért kétbites
Egy 21-mer = 42 bit = egyetlen egész szám. A következő k-mer egy eltolás és egy maszk.
A szekvenciaelemzés alapfogása. A k-mer a szekvencia k hosszú részlete — mondjuk huszonegy bázis. Négyféle bázis két biten elfér, tehát egy huszonegyes k-mer negyvenkét bit: egyetlen egész szám. És ha a következő k-merre lépsz, az nem új számolás, hanem egy eltolás és egy maszkolás. Ez ugyanaz a gondolat, mint a hetedik héten az oszloporientált tárolás: a tárolás alakja maga a feldolgozás sebessége.
09
Számold ki: a lefedettség
A `bio-sequence` demó tanpéldája: 200 000 leolvasás, 150 bázis, 300 000 bázisos genom.
A lefedettség a szekvenálás legfontosabb tervezési száma, és három dologból jön: hány leolvasás, milyen hosszúak, mekkora a genom. Az alapbeállítás a demóé: kétszázezer leolvasás, százötven bázis, háromszázezer bázisos genom — százszoros lefedettség. Most told a genom méretét a háromszorosára: a lefedettség harmadára esik, pedig ugyanannyit szekvenáltál. Ez az a szám, amit egy ajánlatkérésnél ki kell számolni, mielőtt bárki gigabájtokról beszél.
10
A k-mer-hisztogram: a hiba és a genom
30 000 leolvasás 21-merjei, kétszeres előfordulástól fölfelé. Az egyszer előfordulók (380 448 k-mer, az összes 55,6 %-a) nem férnek rá — ők a hibák.
Ez az ábra a bioinformatika egyik legtöbbet nézett képe, és modell nélküli minőségellenőrzés. Megszámoljuk, hány k-mer fordul elő egyszer, kétszer, háromszor. Az egyszer előfordulókból háromszáznyolcvanezer van — ezek szinte mind szekvenálási hibát tartalmaznak, mert a hibás k-mer a genomban sehol nincs meg. Az ábráról szándékosan lehagytam őket: egy oszlopban a háromszáznyolcvanezer mellett a többi egy vonallá lapulna. Ami itt látszik, az a másik csúcs, a genomé — tizenegynél.
11
Miért nem a lefedettségnél van a csúcs
A mért csúcs 11×. A képlet 11,7-et ad — a kettő egyezése igazolja, hogy jól olvassuk a hisztogramot.
És most egy ellenőrzés, ami miatt ezt a demót szeretem. A várt lefedettség ezen a részhalmazon tizenhárom, a mért csúcs viszont tizenegy. Ez nem hiba. Egy huszonegyes k-mer csak akkor hibátlan, ha mind a huszonegy bázisa az — ez nulla egész kilenc, tehát a k-merek tíz százaléka hibás bázist tartalmaz. Tizenhárom szorozva nulla egész kilenccel: tizenegy egész hét. A mért tizenegy. Ha egy ilyen ellenőrzés kijön, akkor érted, mit mérsz.
12
Számold ki: hol lesz a k-mer csúcs
A `bio-sequence` demó részmintája: a 21-mer számlálás lefedettsége 13,0×.
Három csúszka. A lefedettség, a szekvenálási hibaarány, és a k-mer hossza. Az alapbeállítás a demóé — és nézd meg, mi történik, ha a k-t huszonegyről harmincegyre tolod: a csúcs lejjebb megy, pedig az adaton semmi nem változott. Az ok az, hogy hosszabb k-merbe több bázis fér, tehát nagyobb eséllyel esik bele legalább egy hibás. Ez az a dia, ami megmagyarázza, miért nem a lefedettségnél van a csúcs — és hogy a k megválasztása nem technikai részlet.
13
Kérdés
A számított lefedettség 40×, a hisztogram csúcsa 5×. Miért?
Kapsz egy FASTQ-készletet, és a k-mer-hisztogramon a púp öt körül van, pedig a lefedettségnek a leolvasásszám alapján negyvennek kellene lennie. Mi a legvalószínűbb magyarázat?
Question
- 1. A szekvenálás sikertelen volt, a készlet használhatatlan.
- 2. A hibaarány jóval magasabb a vártnál, vagy a genom nagyobb, mint amivel számoltál.
- 3. A k túl kicsi, ezért minden k-mer sokszor fordul elő.
A csúcs a lefedettség szorozva a hibátlan k-mer valószínűségével. Ha a csúcs nyolcadakkora a vártnál, akkor vagy a nevező rossz — a genom nagyobb, tehát a valódi lefedettség kisebb —, vagy a (1−hiba)^k tényező sokkal kisebb, mint hitted. A harmadik válasz a fordítottját mondja: kisebb k-nál a k-merek gyakrabban ismétlődnek, tehát a csúcs feljebb kerülne, nem lejjebb.
14
Referenciához illesztés vagy összeállítás
Referenciához illesztés: gyorsabb és egyszerűbb · megmondja, hol tér el a mintád · amit a referencia nem tartalmaz, azt nehezen látja meg | Összeállítás: referencia nélkül is megy · új szakaszokat is megtalál · az ismétlődő részek a korlátja, nem a gépteljesítmény
Két út vezet a leolvasásoktól a válaszig. Ha van referenciagenom a fajhoz, akkor illesztünk: megkeressük, honnan származik minden leolvasás. Ha nincs, vagy éppen az érdekel, ami a referenciában nincs benne, akkor összeállítunk. Az agráriumban a főbb szántóföldi növényeknek van referenciájuk; a talajbaktériumok nagy részének nincs.
15
A teljes kép: méretek és a k-mer-hisztogram
A `bio-sequence` demó ábrája: bal oldalt a méretek nyersen és tömörítve, jobb oldalt a k-mer-hisztogram logaritmikus tengelyen.
Itt a demó saját ábrája, és ezen látszik az, amit a korábbi dián le kellett vágnom. A jobb oldali hisztogram logaritmikus tengelyen áll, tehát az egyszer előforduló háromszáznyolcvanezer k-mer és a tizenegyes csúcs harmincnégyezerje EGYSZERRE fér rá. Így látod meg, hogy a hibacsúcs nem egy kicsit nagyobb, hanem egy nagyságrenddel — és hogy a kettő között van egy völgy, ami a vágási pontot megmutatja.
16
A szekvenálási lánc — formátumról formátumra
FASTQ — nyers leolvasás minőségértékekkel · minőségellenőrzés és vágás — FastQC, fastp: adapter, rossz végek · illesztés a referenciára — BWA vagy Bowtie rövidre, minimap2 hosszúra · SAM/BAM — hova került melyik leolvasás, indexelve · rendezés, szűrés, lefedettség — samtools és rokonai · variánshívás — GATK, bcftools: hol tér el a minta · VCF — pozíció, allél, minőség, genotípus mintánként · elemzés — PLINK, R/Bioconductor: asszociáció, szelekció
Ezt a láncot érdemes egyszer egészben látni, mert a bioinformatika erősen formátumvezérelt: a lépéseket nem a programok kötik össze, hanem a FÁJLFORMÁTUMOK. Ha a formátumokat ismered, bármelyik lépéshez találsz eszközt — és ha egy lánc leírásában elakadsz, az általában azért van, mert nem tudod, melyik formátumban vagy éppen. Balról jobbra: nyers leolvasás, minőségszűrés, illesztés, feldolgozás, variánshívás, elemzés. Mindegyik nyíl egy formátumváltás.
17
Mintametaadat: amit utólag nem lehet pótolni
Mikor: a mintavétel időpontja · Hol: a pontos hely, koordinátával · Mélység: milyen rétegből · Tétel: melyik feldolgozási körrel · Ki: a mintavevő — ez a mintavételkor kerül feljegyzésre vagy soha
A blokk zárógondolata, és ez a legkevésbé technikai mondat az egészben. A szekvencia önmagában nem elemezhető, csak tárolható. Kell hozzá, hogy mikor, hol, milyen mélységből, milyen tétellel vették a mintát. Ez a metaadat a mintavételkor kerül feljegyzésre vagy soha — utólag nem szerezhető meg. Több elemzés bukott már el ezen, mint rossz statisztikán.
18
Amit a lánc minden lépésénél rögzíteni kell
amit rögzíteni kell | miért | mivel · referenciaváltozat | a pozíciók kiadásonként eltolódnak — két VCF nem vethető össze | a metaadatban és a fájlfejlécben · eszközverziók | ugyanaz az illesztő két kiadása más illesztést ad | konténerkép (Docker, Apptainer) · paraméterek és küszöbök | a variánsszűrés a lánc legnagyobb hatású döntése | a munkafolyamat leírásában, nem szkriptben · véletlenmag | ahol a lépés sorsol, ott a futás nem ismételhető | a lánc paramétereként · a lánc maga | hat hónap múlva a parancssori előzmény nincs meg | munkafolyamat-motor (Nextflow, Snakemake)
Egy genomikai elemzés akkor ér valamit, ha fél év múlva újra elő tudod állítani. Ehhez öt dolgot kell rögzíteni, és mind az öt olyan, amit a fájlok maguk NEM tartalmaznak. A referenciaváltozat, mert a koordináták kiadásonként elcsúsznak. Az eszközverziók, mert egy illesztő két kiadása más eredményt ad. A paraméterek. A véletlenmag, ahol van. És a szűrési küszöbök, mert azok viszik a legnagyobb hatást. Ezt hívják reprodukálhatóságnak, és nem adminisztráció: enélkül a saját eredményedet sem tudod megvédeni.
19
Nemesítés: marker, küszöb, tenyészérték
Húszezer próba, öt valódi hatás — és mit kezdjünk ezzel
Második blokk, és ez a modul leggyakorlatibb része. A nemesítés az az agrárterület, ahol a genomikai adat ma valóban döntést támogat — nem kísérletet. A kérdés, amit végigviszünk: mikor van értelme markert keresni, és mikor kell helyette becsülni.
20
Több marker, mint megfigyelés
300 megfigyelés, 20 000 változó. A tökéletes illeszkedés itt nem eredmény, hanem a dimenziószám következménye.
Ez a genomikai adat legfontosabb tulajdonsága, és a kurzus eddigi anyagának a legnagyobb próbája. Háromszáz nemesítési vonalad van, és húszezer markered. Ilyenkor mindig létezik olyan markerkombináció, amely a hozamot tökéletesen megmagyarázza — akkor is, ha egyetlen marker sem hat. Nem azért, mert hibáztál, hanem mert húszezer dimenzióban háromszáz pont mindig elfér egy síkon.
21
Húszezer próba, öt valódi hatás
Minden pont egy marker. A magasság a −log₁₀ p. A 0,05-os küszöb 1,3-nál, a genomszintű 5,6-nál van. A teljes, húszezer pontos ábra a jegyzetfüzetben.
Ez egy szimulált asszociációvizsgálat, és azért szimulált, mert így tudjuk az igazságot: öt marker hat valóban, a többi tizenkilencezer-kilencszázkilencvenöt nem. A függőleges tengelyen a p-érték negatív logaritmusa áll — minél magasabb, annál kisebb a p. Nézd meg, mennyi pont van a 0,05-os vonal fölött. Kilencszáznyolcvannyolc. És ebből négy valódi.
22
Miért kell korrigálni — a képlet
Húsz független próbánál már 64 százalék az esélye legalább egy téves riasztásnak — valódi hatás nélkül.
Itt van számokban, miért nem lehet húszezer próbát öt százalékos szinten futtatni. Ha a próbák függetlenek, annak az esélye, hogy EGYIK sem ad téves riasztást, nulla egész kilencvenöt a k-adik hatványon — és ez k növelésével gyorsan nullához megy. A Bonferroni ezt úgy rendezi, hogy a szintet elosztja k-val; a Holm ugyanezt lépcsősen, és emiatt erősebb. A harmadik sor más kérdésre válaszol: az FDR nem azt szorítja le, hogy legyen-e téves riasztás, hanem azt, hogy a TALÁLATOK hány százaléka téves.
23
Ugyanaz az adat, három küszöb
küszöb | találat | ebből valódi | ebből hamis · p < 0,05 | 988 | 4 | 984 · genomszintű, p < 2,5·10⁻⁶ | 3 | 3 | 0 · FDR 5 % | 3 | 3 | 0
Itt a mért eredmény táblázatban. Ötszázalékos p-értékkel kilencszáznyolcvannyolc találat, ebből négy valódi: a lista nulla egész négy százaléka igaz, tehát használhatatlan. A genomszintű küszöb — a nulla nulla öt elosztva húszezerrel — három találatot hagy, és mind a három valódi. A hamis felfedezési arány szerinti eljárás itt ugyanazt adja. De figyelj a második oszlopra is: a genomszintű küszöb két valódi hatást elveszít.
24
Ugyanez húsz kezelésen, szántóföldi kísérletben
A `stat-multiple` demó ábrája: húsz hatástalan kezelés, korrekcióval és anélkül.
Hogy a húszezer marker ne tűnjön külön világnak, itt ugyanez a jelenség húsz kezelésen. Húsz készítmény, mindegyik teljesen hatástalan, tizenkét ismétléssel. Korrekció nélkül az esetek negyvennyolc százalékában lesz köztük legalább egy szignifikáns, és futásonként átlagosan egy egész huszonkilenc találat. Holm-korrekcióval ugyanez nyolc egész két százalék — ott van, ahol lennie kell. Érdemes megnézni a tankönyvi képletet is: hatvannégy egész kettőt jósol. A mért érték tizenhat ponttal kisebb, mert a húsz próba ugyanazt a kontrollt használja, tehát nem függetlenek. Ez a szám tehát nem cáfolat, hanem a kísérlet szerkezetének lenyomata.
25
A küszöb ára számokban
A `bio-gwas` demó kimenete. Ugyanez a cella a bio_nemesites.ipynb jegyzetfüzetben.
A demó kimenetében ott van az, amit a táblázat nem mond el. Az öt valódi hatás nagysága nulla egész negyvenöt, harmincöt, huszonnyolc, húsz és tizennégy szórásegység. A genomszintű küszöb az első hármat megtalálja, az utolsó kettőt nem. Ez nem a küszöb hibája — ez a küszöb ára. Háromszáz vonalból egy nulla egész tizennégyes hatást nem lehet ilyen szigorú küszöbbel kimutatni, akárhogy is szeretnénk.
26
Kérdés
p = 0,01 egy markerre. Mi az első kérdés?
Egy kolléga azzal jön, hogy talált egy markert, amely nulla nulla egyes p-értékkel kapcsolódik a szárazságtűréshez, és szeretné beépíteni a nemesítési programba. Mi az első kérdésed?
Question
- 1. Mekkora a hatás nagysága gyakorlati egységben?
- 2. Hány markert vizsgált meg összesen, amíg ezt megtalálta?
- 3. Megismételhető-e a mérés ugyanazon a mintán?
A p-érték nem egyetlen eredmény tulajdonsága, hanem az eljárásé, amely előállította. Húszezer markerből válogatva a 0,01-es p-érték semmit nem jelent: a mérésünkben kilencszáznyolcvannyolc ilyen vagy jobb találat volt, és ebből kilencszáznyolcvannégy hamis. A hatásnagyság fontos kérdés, de csak azután, hogy a találat egyáltalán komolyan vehető. A harmadik válasz pedig nem segít: ugyanazon a mintán a megismétlés ugyanazt adja — független mintán kellene.
27
A populációszerkezet: a genomika Simpson-paradoxona
Ha a minta alcsoportokra bomlik, és az alcsoportok a tulajdonságban is eltérnek, akkor minden csoportjelző marker „találat” lesz.
És most a csapda, amit a küszöb nem old meg. Tegyük fel, hogy a mintád kétféle tájfajtából áll, és az egyik csoport átlagosan jobb hozamú — akár a genetikától teljesen független okból, mondjuk mert máshol termesztik. Ekkor minden marker, amely a két csoportot megkülönbözteti, kapcsolatot mutat a hozammal. Nem hamis pozitív a szó statisztikai értelmében: a kapcsolat valóban ott van az adatban. Csak nem oksági, és a nemesítésben haszontalan.
28
Ugyanez a jelenség, agronómiai adaton
A `stat-simpson` demó ábrája: táblán belüli és összevont meredekség, kilenc táblán.
Ez ugyanaz a paradoxon, csak ismerősebb adaton — az 5. hétről már láttad. Kilenc tábla, mindegyiken nitrogén és hozam. Táblán BELÜL a meredekség pozitív, nulla egész nulla-egy-egy-négy, és mind a kilencen pozitív. Összevonva mínusz nulla egész nulla-négy-három-kilenc: ellentétes előjel, ugyanabból az adatból. Az ok nem statisztikai, hanem agronómiai: a gyengébb táblákra megy több nitrogén. A genomikában a tábla helyét az alcsoport veszi át. Ha a minta populációkra bomlik, és a populációk a tulajdonságban is eltérnek, akkor minden csoportjelző marker találatnak fog látszani — pedig csak a származást jelzi.
29
Markerkeresés vagy genomikus szelekció
Markerkeresés (GWAS): melyik marker hat? · szigorú küszöb kell · néhány nagy hatásnál működik · az eredménye lista | Genomikus szelekció: mennyit ér az egyed? · az ÖSSZES markert használja · sok kis hatásnál működik · az eredménye rangsor
Itt válik szét a két megközelítés, és ez a blokk gyakorlati tanulsága. A markerkeresés azt kérdezi: melyik marker hat. Ez akkor működik, ha van néhány nagy hatású marker — betegségellenállóságnál gyakran van ilyen. A hozam viszont nem így működik: sok száz kis hatás eredője. Ott nem markert keresünk, hanem az összeset együtt használjuk tenyészérték becslésére. A küszöb ilyenkor nem is kell — nem listát közlünk, hanem rangsorolunk.
30
Mind a húszezer marker, egy ábrán
A `bio-gwas` demó ábrája: minden marker, a 0,05-ös és a genomszintű küszöbbel.
A korábbi dián csak huszonhárom pontot tudtam megmutatni a húszezerből, mert a keretrendszer rajza nem visz el ennyit. Itt a demó saját ábrája az összessel. Most látod, mi az igazi arány: a szürke felhő a tizenkilencezer-kilencszázkilencvenöt nem ható marker, és a nulla nulla ötös vonal fölött ebből majdnem ezer ül. Az öt narancs pont a valódi hatás — kettő közülük a felső vonal alatt marad, tehát elveszne.
31
Az örökölhetőség mint felső korlát
Az örökölhetőség felső korlát a genomikus becslés magyarázóerejére. A fölötte lévő eredmény gyanú, nem siker.
Egy szám, amit érdemes minden ilyen projekt elején kiírni a táblára. Az örökölhetőség azt mondja meg, a megfigyelt változékonyság mekkora hányada magyarázható genetikai különbséggel. Ha egy tulajdonság örökölhetősége nulla egész három, akkor a legjobb genomikus modell sem magyarázhat többet harminc százaléknál — a maradék a környezet és a mérés. Aki ennél jobb eredményt közöl, az vagy szivárogtat, vagy a környezetet tanulta meg.
32
Az öt valódi hatásból három jön vissza
A `bio-gwas` demó mérése: az öt valódi markerhatás, és amit a genomszintű küszöb meghagy.
Itt látszik, miért nem a markerlista a cél. A generátorba öt valódi hatást raktunk, és tudjuk, mekkorák — szórásegységben nulla egész negyvenöt, harmincöt, huszonnyolc, húsz és tizennégy. A genomszintű küszöb a felső hármat találja meg. A két gyengébbet levágja: nem azért, mert nincsenek ott, hanem mert ennyi megfigyeléssel nem lehet megkülönböztetni őket a zajtól. A megtalálható rész tehát felülről korlátos, és ezt a korlátot a mintaszám és az örökölhetőség adja, nem a módszer. Aki a korlát fölötti magyarázóerőt közöl, az nem jobb modellt talált, hanem szivárgást.
33
Az örökölhetőség képlete
A megfigyelt változatosság genetikai hányada. A szűk értelmű h² az, ami a szelekcióban számít.
Az örökölhetőség a megfigyelt változatosság genetikai hányada. A tág értelmű a teljes genetikai varianciát nézi, a szűk értelmű csak az additív részt — és a nemesítésben ez utóbbi számít, mert csak az additív rész öröklődik megbízhatóan. Két dolgot érdemes megjegyezni róla. Az első: felső korlát arra, amit BÁRMILYEN marker alapú modell elérhet. A második, amit gyakran elfelejtenek: az örökölhetőség nem a tulajdonság állandója, hanem a POPULÁCIÓÉ és a környezeté. Ugyanaz a tulajdonság más állományban más h²-t ad.
34
A szétvágás genomikai adaton
Rokonság szerinti szétvágás, nem véletlen. És a tétel ne essen egybe a vizsgált csoporttal.
És ebből következik a blokk utolsó gyakorlati szabálya. A nyolcadik héten azt mondtuk, hogy ugyanabból a táblából ne kerüljön minta a tanítóba és a tesztbe. Itt ugyanez a rokonságra vonatkozik. Ha egy vonal testvére benne van a tanítóhalmazban, akkor a teszteredmény hazudik — a modell a családot ismerte fel, nem a genetikát. És ugyanígy a tétel: ha az egyik csoportot tavaly, a másikat idén genotipizálták, akkor a tételhatás és a csoport szétválaszthatatlan.
35
Amikor az egyed szivárog át
A `cv-leakage` demó mérése: 100 egyed, egyedenként 5 felvétel, kétféle szétvágással.
Mérés arra, mit csinál a rossz szétvágás, ha a megfigyelések nem függetlenek. Ez képi adat, de a szerkezete ugyanaz, mint a rokonságé: száz növény, mindegyikről öt felvétel. Ha képenként sorsolunk, a pontosság kilencvenkilenc egész nyolc. Ha növény szerint vágunk — egy növény minden képe egy oldalra kerül —, hatvannégy egész nulla. Harmincöt egész nyolc százalékpont a különbség, és nem a modellről szól. A mechanizmus is látszik: véletlen szétvágásnál a teszt képek kilencvennyolc egész négy százalékának a legközelebbi szomszédja ugyanannak a növénynek egy másik felvétele. A modell nem a betegséget ismeri fel, hanem az egyedet. Genomikán a testvérvonal pontosan ezt csinálja.
36
Talajmikrobiom: amikor az adat hányad
Zárt adat, zárási hatás, és mit mér valójában a korreláció
Harmadik blokk. A talajmikrobiom vizsgálata ma olcsó, és ezért egyre több agrárprojektben megjelenik. A baj az, hogy a kimenete olyan adatfajta, amire a szokásos statisztikai reflexeink nem működnek — és ez nem nyilvánvaló addig, amíg valaki meg nem méri. Most meg fogjuk mérni.
37
Nem sejtszámot kapsz, hanem hányadot
A leolvasásszám a szekvenálásról szól, nem a talajról. Ezért hányaddal dolgozunk — és ettől az összeg rögzített.
Az első dolog, amit tisztázni kell. A 16S-vizsgálat leolvasásokat ad, és a leolvasások száma mintánként más — attól függ, mennyi került a szekvenálóba, nem attól, mennyi baktérium volt a talajban. Ezért mindenki relatív gyakoriságra vált: hány százalékát teszi ki egy taxon a leolvasásoknak. Ez elkerülhetetlen, és ez a forrása minden további bajnak. Az összeg ugyanis ettől kezdve rögzített: mindig száz százalék.
38
Egy taxon, amely a leolvasások felét viszi
A `bio-compositional` demó beállítása: 120 talajminta, 12 taxon, egy domináns.
Hogy lássuk, miért nem ártatlan a hányad: ebben a mérésben tizenkét taxon osztozik a leolvasásokon, és az egyik egymaga negyvenkilenc egész négy százalékot visz. A többi tizenegy átlagosan négy egész hat százalékot. Most gondold végig, mi történik, ha a domináns taxon abszolút mennyisége megnő a talajban. A leolvasásszám nem nő, mert a szekvenáló kapacitása rögzített — tehát a többi taxon hányada MIND lecsökken, anélkül hogy a talajban bármelyikük megfogyott volna. Ez nem ökológia, hanem az összeg rögzítettsége. Ezért nem lehet a hányadokat úgy olvasni, mintha mennyiségek lennének.
39
A zárási hatás, egyetlen képletben
Mért ↔ számolt: 3 taxon −0,500 ↔ −0,500 · 6: −0,200 ↔ −0,200 · 12: −0,090 ↔ −0,091 · 40: −0,025 ↔ −0,026 · 200: −0,005 ↔ −0,005
Ha az összeg rögzített, akkor az egyik rész növekedése a többi csökkenése. Ez nem ökológia, hanem számtan. Egyenlő nagyságú részeknél a hamis korreláció pontosan kiszámolható: mínusz egy per k mínusz egy. Három résznél ez mínusz egy fél — óriási. Kétszáz résznél mínusz nulla nulla nulla öt — elhanyagolható. A demó mind az öt esetet lemérte, és a mért érték három tizedesjegyig egyezik a képlettel.
40
Az átlag elfedi, hol van a hiba
12 taxon, egyikük a leolvasások 49,4 %-a. Az abszolút mennyiségek függetlenek — minden korreláció, ami itt látszik, a zárás műve.
Ez a blokk legfontosabb ábrája. Ugyanaz a száztizenhúsz minta, tizenkét taxon, amelyek abszolút mennyisége egymástól független — ezt tudjuk, mert mi állítottuk elő. A relatív gyakoriságon az átlagos korreláció mínusz nulla nulla kettő: gyakorlatilag nulla. Ha csak ezt nézed, azt mondod, nincs baj. De bontsd szét. A domináns taxon párjainál mínusz nulla egész négy, a többi páron plusz nulla egész nyolc. Az átlag azért nulla, mert a kettő kioltja egymást.
41
Hol lakik a hamis korreláció
A `bio-compositional` demó második ábrája: a taxonpárok korrelációs mátrixa abszolút bőségen és relatív gyakoriságon.
A hisztogram azt mondta meg, hogy VAN hamis korreláció. Ez megmondja, HOL. Két korrelációs mátrix, ugyanazokra a taxonokra. Bal oldalt az abszolút bőség: egyenletesen halvány, nincs szerkezet — ahogy kell, hiszen függetlennek állítottuk elő. Jobb oldalt a relatív gyakoriság. Nézd meg az első sort és az első oszlopot: végig sötétkék, vagyis erősen negatív. Az a domináns taxon. És nézd meg a maradék mezőt: enyhén piros, tehát gyengén pozitív. Egyik sem ökológia.
42
És amit én is rosszul tudtam
A `bio-compositional` demó kimenete. Relatív: −0,002 · CLR: −0,091 · a CLR rosszabb, nem jobb.
Most jön az a rész, amit szeretnék, ha megjegyeznél — nem a számot, hanem az eljárást. Amikor ezt a demót megírtam, azt a mondatot írtam a végére, hogy a centrált logaritmikus arány visszahozza a korrelációt a nullához. Ezt olvastam, ezt hittem. Aztán lefuttattam, és mínusz nulla nulla kilencet kaptam — rosszabbat, mint a nyers relatív gyakoriságon. Nem a mérést javítottam ki, hanem a mondatot.
43
Ami tényleg segít: a log-arány
log(a/s) − log(b/s) = log(a) − log(b). Az osztó kiesik — ezért használható zárt adaton.
Mi az, ami működik? Az, amiből az osztó kiesik. Ha két taxon hányadának a logaritmusát kivonod egymásból, akkor az összeg, amivel osztottunk, eltűnik: log a per s mínusz log b per s egyenlő log a mínusz log b. Ez nem trükk, hanem a zárt adat egyetlen értelmes algebrája. Az erre épülő arányossági mérőszám azt kérdezi, hogy a két taxon log-arányának szórása kicsi-e — és ez a kérdés attól független, mire normáltunk.
44
És amit a CLR NEM old meg
A `bio-compositional` demó mérése: az átlagos páronkénti korreláció három ábrázolásmódon.
Ezt a diát a saját tévedésem miatt kellett átírni, ezért érdemes megnézni. Az abszolút bőségen az átlagos korreláció mínusz nulla egész nulla-nulla-három — nulla körül, ahogy előállítottuk. A relatív gyakoriságon mínusz nulla egész nulla-nulla-kettő: látszólag semmi. A centrált log-arányon mínusz nulla egész nulla-kilenc-egy — vagyis a CLR nem javítja meg, hanem rontja. Az ok az, hogy a CLR maga is nullára összegződik: kicseréli az egyik zárást egy másikra. Ami tényleg működik, az a páronkénti log-arány, amiből az arányosság számolható: ott nulla egész nulla-öt-hét jön ki. A log-arány tehát nem azért jó, mert transzformáció, hanem mert az OSZTÓ kiesik belőle.
45
Kérdés
Erős negatív korreláció, és az egyik taxon 40 %. Mi az ellenvetés?
Egy mikrobiom-tanulmány azt közli, hogy két talajbaktérium-csoport erősen negatívan korrelál, és ebből versengésre következtet. Az egyik csoport a leolvasások negyven százalékát teszi ki. Mi az első ellenvetésed?
Question
- 1. A mintaszám valószínűleg túl kicsi a következtetéshez.
- 2. Egy domináns taxon zárás miatt mindennel negatívan korrelál — ez lehet műtermék.
- 3. A korreláció nem oksági, tehát versengésre nem lehet belőle következtetni.
A harmadik válasz igaz, de minden korrelációra igaz, tehát nem erről a tanulmányról mond valamit. Itt a konkrét probléma az, hogy a domináns taxon negatív kapcsolata a zárás matematikai következménye: a mérésünkben független mennyiségekből is mínusz nulla egész négyet adott. Az ellenvetés tehát nem az, hogy „a korreláció nem okság”, hanem az, hogy itt korreláció sincs — csak zárás. Log-arány alapú elemzéssel lehetne eldönteni.
46
A leolvasási mélység is összehasonlíthatósági kérdés
Mélyebb szekvenálás = több megtalált ritka taxon = magasabb mért diverzitás, változatlan talajon.
Egy második, kevésbé látványos csapda, ami ugyanoda vezet. A diverzitás — hányféle taxont találtunk — függ attól, hány leolvasás jutott a mintára. Mélyebben szekvenálva több ritka taxont látsz meg, tehát magasabb diverzitást mérsz, ugyanazon a talajon. Ha a mintáid mélysége eltér, akkor a diverzitáskülönbségük részben a szekvenálásról szól, nem a talajról.
47
A három eloszlás, és a −1/(k−1) szabály
A `bio-compositional` demó ábrája: a korrelációk eloszlása, és a zárási hatás a taxonszám függvényében.
A demó teljes ábrája. Bal oldalt a taxonpárok korrelációinak eloszlása három alakban: az abszolút bőség nulla körül, ahogy kell; a relatív gyakoriság szélesebben; a centrált log-arány pedig — és ez az, amit rosszul tudtam — még szélesebben. Jobb oldalt a mért átlag és a képlet: három taxontól kétszázig három tizedesjegyig egyeznek. Ha egy elméleti képlet és egy szimuláció ilyen pontosan egyezik, akkor mindkettőt jól csináltuk.
48
A mikrobiom-lánc eszközei — és hol lesz az adat hányad
lépés | mit ad | amit nem mond ki · minőségszűrés, párosítás | tisztított leolvasások | a mélység mintánként eltérő marad · leolvasás-feldolgozás (DADA2, QIIME 2) | ASV- vagy OTU-táblázat | innentől az adat HÁNYAD, nem sejtszám · taxonómiai besorolás | ki melyik taxon | a besorolás adatbázisfüggő és hiányos · normálás, ritkítás | összevethető minták | a ritkítás adatot dob el — és ezt ki kell mondani · diverzitás, összehasonlítás | alfa- és béta-diverzitás | a korreláció kompozicionális adaton hamis jelet ad
A mikrobiom-oldalon is végig kell nézni a láncot, mert itt van egy csapda, amiről a lánc vége nem szól. A nyers leolvasásból a feldolgozó lánc taxon-táblázatot csinál, és ez a táblázat HÁNYADOKAT tartalmaz, nem sejtszámot. A program nem mondja ki, hogy ettől kezdve kompozicionális adattal dolgozol — a felhasználónak kell tudnia. Nézd meg a harmadik oszlopot: minden lépésnél odaírtam, mit NEM kap meg az ember.
49
Az alfa-diverzitás képletei
Három mérőszám, három súlyozás: a ritkák számítanak-e, és mennyire.
A diverzitás nem egyetlen szám, hanem egy család — és a tagjai másra érzékenyek. A fajgazdagság csak megszámolja a taxonokat: a ritkákat ugyanúgy súlyozza, mint a dominánsakat, ezért a leolvasási mélységre nagyon érzékeny. A Shannon-index a hányadokat logaritmikusan súlyozza: a ritkák számítanak, de kevésbé. A Simpson-index pedig négyzetre emel, tehát szinte csak a dominánsakat nézi. Ha két minta Shannon-indexe azonos, de a Simpsonja nem, akkor a különbség a ritka taxonokban van.
50
A tételhatás
Ha a tétel egybeesik a csoporttal, a hatásuk szétválaszthatatlan. Ez tervezési kérdés, nem elemzési.
És a harmadik, ami minden szekvenálásos projektet fenyeget. A feldolgozás körülménye — melyik futtatás, melyik kit, melyik labor — nyomot hagy az adaton, és ez a nyom gyakran erősebb, mint a biológiai jel. A veszélyes eset nem az, hogy van tételhatás. Az, hogy a tétel egybeesik a vizsgált csoporttal: a kezelt mintákat kedden dolgozták fel, a kontrollt csütörtökön. Ekkor a kettő szétválaszthatatlan, és nincs az a statisztika, amivel utólag ki lehetne bogozni.
51
Hogyan néz ki egy tételhatás, ha meg lehet mérni
A `cv-domainshift` demó mérése: ugyanaz a modell, más felvételi körülmények között.
A tételhatást talajmintán nehéz kimérni, mert nem tudjuk, mi lett volna a másik tétellel. Képi adaton viszont igen, és a szerkezete ugyanaz. Ugyanaz a modell, ugyanaz az adat, egyetlen különbség: a felvételek más megvilágításban készültek. Azonos fényen kilencvenegy egész egy százalék, eltolt fényen hetvenkilenc egész öt — tizenegy egész hat pontos esés. És ami a legkellemetlenebb: a modell erről nem szól. A döntéseihez tartozó magabiztossága alig változik. A csatornánkénti fehéregyensúly a romlás nyolcvanöt százalékát visszahozza, de ez utólagos javítás. A helyes válasz a mintavétel tervezésénél van: a tétel ne essen egybe a vizsgált csoporttal.
52
Kórokozó-kimutatás: a pozitív eredmény jelentése
Egy jó teszt is rosszul szól, ha a kórokozó ritka
Utolsó blokk, és ez az, ahol az adatból döntés lesz. Egy növényvédelmi laborban a kérdés nem az, hogy jó-e a teszt. Az, hogy mit tegyünk, ha pozitív. És kiderül, hogy erre a teszt jellemzőiből önmagában nem lehet válaszolni.
53
Három szám, nem kettő
szám | mit mond | miről szól · Érzékenység | megtalálja-e a fertőzöttet | a tesztről · Fajlagosság | hallgat-e az egészségesre | a tesztről · Alapgyakoriság | milyen gyakori a kórokozó | az ÁLLOMÁNYRÓL — és mégis ez dönt
A tesztekről rendszerint két számot közölnek. Az érzékenység azt mondja meg, a fertőzöttet mekkora eséllyel találja meg. A fajlagosság azt, hogy az egészségesre mekkora eséllyel nem szól. Mindkettő a tesztről szól, és mindkettő rögzített. De az a kérdés, ami téged érdekel — hogy egy pozitív eredmény mit jelent — ebből a kettőből nem válaszolható meg. Kell hozzá egy harmadik szám: hogy milyen gyakori a kórokozó abban az állományban, ahol vizsgálsz.
54
A Bayes-tétel, és hol a fordulópont
A pozitív lelet jelentése a fertőzöttségtől függ — ugyanaz a teszt, más állomány, más következtetés.
Itt van a három szám kapcsolata képletben. A pozitív prediktív érték — vagyis hogy egy pozitív lelet mögött tényleg fertőzés áll-e — a Bayes-tételből jön, és benne van a fertőzöttség. Ebből következik a második képlet, ami a modul egyik legszebb eredménye: ki lehet számolni, milyen fertőzöttség alatt lesz a pozitívak TÖBBSÉGE téves. A válasz egy per plusz — és a mi tesztünkre ez egy egész nulla négy százalék. A demó ezt meg is méri, és ugyanez jön ki.
55
Számold ki: mit jelent egy pozitív lelet
A `bio-diagnosis` demó tesztje: 95 % érzékenység, 99 % fajlagosság.
Három csúszka, és ez a dia egy egész félévnyi félreértést old meg. Az alapbeállítás a demóé: kilencvenöt százalék érzékenység, kilencvenkilenc százalék fajlagosság, egy százalék fertőzöttség — és a pozitívaknak alig a fele valódi. Most told a fertőzöttséget nulla egész egy százalékra, ahogy egy mentes állományban van: a pozitívak kevesebb mint tíz százaléka valódi. A teszt közben nem lett rosszabb. Csak az állomány lett más. Aztán próbáld a másik irányt: told a fajlagosságot kilencvenkilenc egész kilencre. Ez a dia magyarázza meg, miért nem szabad tünetmentes állományt szűrni ok nélkül.
56
Ugyanaz a teszt, hatféle állományban
Érzékenység 95 %, fajlagosság 99 %. A vízszintes tengely a fertőzöttség százalékban.
Itt a mérés. Kilencvenöt százalékos érzékenység, kilencvenkilenc százalékos fajlagosság — ez jó tesztnek számít. A vízszintes tengelyen a fertőzöttség, a függőlegesen az, hogy a pozitívak hány százaléka valódi. Nézd meg a bal oldalt. Ezrelékes fertőzöttségnél a pozitívak nyolc egész hét százaléka valódi: minden tizenegyedik riasztás igaz, a többi tíz téves. Egy százaléknál negyvenkilenc: minden második.
57
A fordulópont
A `bio-diagnosis` demó kimenete. Ugyanez a cella a bio_diagnosztika.ipynb jegyzetfüzetben.
A demó kiszámolja azt a pontot is, ahol a pozitívak fele valódi: egy egész nulla négy százalékos fertőzöttségnél. Ez alatt a riasztásaid többsége téves. Érdemes ezt a számot megnézni közelebbről — nem a tesztről szól, hanem arról, hogy a fajlagosság hiánya, az az egy százalék, mennyi téves riasztást termel. Ezer mintából tíz téves pozitív jön ki mindig, függetlenül a fertőzöttségtől. A valódiak száma viszont a fertőzöttséggel együtt mozog.
58
Mit lehet tenni, ha a fordulópont alatt vagy
Fajlagosabb teszt: közvetlen, de drágább · Megerősítő második kör: olcsó első kör, drága második · a pozitívakra szűkítve | Célzott szűrés: oda menni, ahol gyakoribb · ingyen van · agronómiai tudás kell hozzá, nem labor
Három út van, és mindhárom valódi költséggel jár. Növelheted a fajlagosságot — de ez rendszerint drágább tesztet jelent. Csinálhatsz megerősítő vizsgálatot a pozitívakon: az első kör olcsó és érzékeny, a második drága és fajlagos. Vagy szűkítheted, hol szűrsz: ha a kockázatos állományokra koncentrálsz, az alapgyakoriság ott magasabb, és ugyanaz a teszt hasznosabb lesz. Ez utóbbi a legolcsóbb, és a legtöbben elfelejtik.
59
Gyűjtött minta: mit nyersz és mit fizetsz
1 %-os fertőzöttségnél, tízes gyűjtésnél: 200 teszt 1000 helyett — ötszörös megtakarítás.
A ritka kórokozó szűrésének a szokásos eszköze. Tíz mintát összeöntesz, és egyszer vizsgálod meg. Ha negatív, mind a tíz negatív — egy teszttel tíz mintát zártál le. Ha pozitív, akkor a tízet külön is meg kell nézni. Egyszázalékos fertőzöttségnél a demó szerint ezer minta kétszáz teszttel elintézhető, ezer helyett. Ötszörös megtakarítás. De van egy ár, amit a számítás nem tartalmaz.
60
Ezer minta, kétszáz teszt
A `bio-diagnosis` demó számítása: 1000 minta átvizsgálása 1 %-os fertőzöttségnél.
A gyűjtött vizsgálat számtana egyszerű, és ezen az ábrán el is fér. Ezer mintát kell átnézni, egy százalékos fertőzöttség mellett. Egyenként vizsgálva ezer teszt. Tízesével gyűjtve először száz teszt fut le a gyűjtött mintákra, aztán azokat a tízeseket, amelyek pozitívak lettek, egyenként is meg kell vizsgálni — ez összesen kétszáz teszt. Ötször kevesebb. A megtakarítás valódi, de két dolgot fizetsz érte. Az egyik: két kört kell szervezni, tehát hosszabb az átfutás. A másik a következő dián jön, és az a fontosabb.
61
A hígulás, amit a számítás nem tartalmaz
Tíz mintában egy fertőzött = tizedannyi célmolekula. A gyűjtött vizsgálat érzékenysége kisebb, és a gyenge fertőzésnél a legkisebb.
Ez az ár. Ha tíz mintában egy fertőzött van, akkor a célmolekulából tizedannyi jut a vizsgálatba. A gyenge fertőzés így a kimutatási határ alá csúszhat — vagyis a gyűjtött minta érzékenysége kisebb, mint az egyedié, és éppen a kezdődő, még kezelhető fertőzéseknél a legrosszabb. Szeretném, ha ezt a mondatot megjegyeznéd: a megtakarítást a demó megmondja, a hígulást neked kell hozzátenni.
62
A teljes görbe, logaritmikus tengelyen
A `bio-diagnosis` demó ábrája: a pozitívak valódi hányada a fertőzöttség függvényében, logaritmikus tengelyen.
És a demó saját ábrája, ahol a vízszintes tengely logaritmikus. Ez azért kell, mert a lényeg a bal szélen történik: ezrelékes és egyszázalékos fertőzöttség között zuhan a pozitív prediktív érték nyolc egész hétről negyvenkilencre. Lineáris tengelyen ez az egész szakasz az ábra bal két százalékába préselődne, és pont az nem látszana, amiről a blokk szól.
63
Kérdés
0,5 % fertőzöttség, 99 % fajlagosság. Miért kezelünk sok tünetmenteset?
Egy szűrési programban ezer mintát vizsgálnak évente, és a pozitívakat mind kezelik. A becsült fertőzöttség fél százalék, a teszt fajlagossága kilencvenkilenc százalék. A gazda azt kérdezi, miért kezelünk annyi tünetmentes állományt. Mit válaszolsz?
Question
- 1. Mert a kezelés megelőző jellegű, és tünetmentesen is indokolt lehet.
- 2. Mert ilyen alapgyakoriságnál a pozitívak kétharmada téves riasztás.
- 3. Mert a teszt érzékenysége túl magas, és emiatt túlzottan érzékenyen jelez.
Fél százalékos fertőzöttségnél a demó szerint a pozitívak harminckét egész három százaléka valódi — a kétharmaduk téves. Ezer mintából öt fertőzött van, közülük a teszt megtalál ötöt; az egészséges kilencszázkilencvenötből viszont tízet tévesen jelöl meg. A harmadik válasz fogalmi hiba: az érzékenység a fertőzöttek megtalálásáról szól, a téves riasztást a fajlagosság hiánya okozza. Az első válasz külön szakmai kérdés, de nem magyarázza a számot.
64
A modul projektjei
Nyolc projekt, belépő, közép és haladó szinten. Mindegyik nyilvános adaton, egyetlen laptopon fut.
Ezzel a modul végére értünk. Nyolc projekt van kidolgozva, és mind fut egyetlen laptopon, nyilvános adaton — laborhozzáférés nélkül. Kettő a nemesítéshez tartozik, kettő a mikrobiomhoz, egy a diagnosztikához, egy a tárolási kérdéshez, és kettő a köztes témákhoz. Amit mindegyikben ugyanúgy kérek: az első oldalon álljon ott, hány megfigyelés van hány változóval szemben, és mi az alapgyakoriság.
65
A modul fogalmai
Leolvasás és lefedettség — a szekvenáló darabokat ad, a lefedettség pedig azt, hányszor olvastunk le egy bázist · FASTQ és Phred-minőség — a nyers formátum, és a bázisonkénti hibavalószínűség logaritmikus kódolása · k-mer és k-mer-hisztogram — k hosszú darabok, és a gyakoriságuk eloszlása; a csúcs helye a lefedettségből jön · SNP-marker és genomszintű küszöb — egybázisos eltérés, és a húszezer próbához igazított szigorúbb határ · Populációszerkezet · Genomikus szelekció és tenyészérték — az ÖSSZES marker együtt, és a belőle becsült rangsor · Örökölhetőség · Kompozicionális adat és zárási hatás — hányad, nem sejtszám; a rögzített összeg hamis negatív korrelációt szül · Log-arány · Leolvasási mélység · Tételhatás · Alapgyakoriság és pozitív prediktív érték — a fertőzöttség, és belőle az, hogy egy pozitív lelet mögött mennyi az esély · Gyűjtött minta · Mintametaadat
Egy mondatban, amit szeretnék, ha megmaradna: a szekvenálásból jövő adat nem azért nehéz, mert biológia. Azért, mert több benne a változó, mint a megfigyelés, mert hányadokból áll, és mert ritka eseményről szól. Mind a három olyan tulajdonság, amire a kurzus eddigi hetei felkészítettek.
66
A modul rövidítései
Rövidítés | Feloldás | Mit jelent · FASTQ | FASTA + Quality | nyers leolvasás minőségértékekkel; négy sor rekordonként · SAM | Sequence Alignment/Map | az illesztés szöveges formátuma: melyik leolvasás hova került · BAM | Binary Alignment/Map | ugyanaz tömörítve és indexelve — az index miatt olvasható ki egyetlen régió · VCF | Variant Call Format | a variánsok táblázata: pozíció, allél, minőség, mintánkénti genotípus · SNP | Single Nucleotide Polymorphism | egyetlen bázis eltérése; a nemesítési markerek többsége ilyen · GWAS | Genome-Wide Association Study | genomszintű asszociációvizsgálat: minden markerre külön próba · FDR | False Discovery Rate | a találatok között a tévesek várható aránya · PPV | Positive Predictive Value | a pozitívak közül hány valódi — a fertőzöttségtől függ, nem csak a teszttől · OTU | Operational Taxonomic Unit | hasonlósági küszöb szerint összevont leolvasáscsoport · ASV | Amplicon Sequence Variant | pontos szekvenciaváltozat, küszöb nélkül — az OTU újabb váltása · CLR | Centered Log-Ratio | centrált log-arány: a kompozicionális adat szokásos átalakítása · qPCR | quantitative Polymerase Chain Reaction | mennyiségi PCR: a célmolekula mennyiségét is megadja · DNS | dezoxiribonukleinsav | a genetikai információ hordozója; angolul DNA · ASCII | American Standard Code for Information Interchange | karakterkódolás; a Phred-érték + 33 ebben a kódban áll a FASTQ-ban · TP, FP, FN, TN | a zavarási mátrix négy cellája | valódi találat, téves riasztás, kimaradt eset, helyes nem — a 8. hét vezeti be · BWA | Burrows–Wheeler Aligner | rövid leolvasások illesztője; programnév, a mögötte álló algoritmusról elnevezve · GATK | Genome Analysis ToolKit | variánshívó eszköztár; programnév · PLINK, QIIME, DADA2, FastQC | programnevek, nem rövidítések | genotípus-elemzés, amplikon-lánc, leolvasás-feldolgozás, minőségellenőrzés
A bioinformatika a kurzus legrövidítésesebb területe, és ez nem véletlen: a lánc lépéseit FÁJLFORMÁTUMOK kötik össze, és a formátumoknak betűszó a nevük. Ha ezt a táblát ismered, egy idegen lánc leírását is végig tudod olvasni.
67
A modul négy diagramtípusa, ugyanazon az adaton
A bioinformatikai modul négy diagramtípusa, ugyanazon az öt értéken.
A modul négy típusa. A pontfelhő panel itt fontosabb, mint amennyit a helye sugall: a Manhattan-ábra húszezer markere csak így fér el egy rajzon, és a küszöb fölé kerülő néhány pont ebből látszik. Vedd észre, hogy ezen az egy panelen a vízszintes tengely NEM sorszám, hanem egy másik mennyiség — ettől lesz pontfelhő, és nem vonal.
68
A bioinformatikai modul diagramtípusai
diagramtípus | mit olvasol le róla | mire NEM jó · oszlop | kategóriák nagyságrendje és sorrendje — a hossz maga az érték | időbeli alakulás: a sorrend nem látszik rajta · vonal | időbeli alakulás: a meredekség és a fordulópontok | kategóriák összevetése: a vonal sorrendet állít oda is, ahol nincs · pontfelhő | két mennyiség együttmozgása, egy pont egy megfigyelés | időbeli sorrend: a pontokból nem derül ki, melyik volt előbb · demóábra | amit a keretrendszer rajza nem tud: log tengely, hőtérkép, kis sokszorosok | saját adatod: ez a demó kimenete, nem szerkeszthető a dián
A modul diagramtípusai. A pontfelhő itt egyetlen helyen áll, de ott kihagyhatatlan: a Manhattan-ábra húszezer markere csak így fér el, és a küszöb fölé kerülő néhány pont ebből látszik.